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转基因动物技术应用研究进展汇总

发布时间:2020-03-04 02:09    浏览次数 :

转基因动物技术应用研究进展汇总_中职中专_职业教育_教育专区。转基因动物技术应用研究进展汇总   转基因动物技术应用研究进展 摘要:本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述,重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转 基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。 然后对转基因技术的应用作了论述,最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字:动物转基因技术;应用;展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods. The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application; prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中 , 从而使其得以表达。自 Palmiter 等 [1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家 对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼 等动物上获得转基因成功。 转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、 发展最快的领域之 一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领 域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品 质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早 , 目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法 , 创始人是 Jaenisch 和 Mintz 等,Gorden 等 和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微 操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中 DNA 的复制过程,将外 源基因整合到 DNA 中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前后的胚胎, 1 [2] 也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的,通过病毒将 外源目的基因插入整合到宿主基因组 DNA 中去。Haskell 等 应用该方法制作了转基因牛。 1.3 核移植法 该方法首先将外源基因导入到供体细胞中,选择其中带有外源基因的细胞进行扩增,然后将 这种细胞的细胞核导入一个去了核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活将重组胚胎直接 或进行体外培养发育到桑葚胚或囊胚后植入同步化的假孕动物的输卵管。1997 年世界上第 一头体细胞克隆羊“多莉” (DOLIY)在英国罗斯林研究所诞生,就应用了该法。安晓荣等 通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊。 1.4 人工酵母染色法 人工酵母染色法(YAC)是一种新型载体。其容量巨大,有克隆百万对碱基的大片段 DNA 的能 力。此法可保证巨大基因的完整性,保证所有顺式作用因子的完整性和完整的结构基因位置 的不变性 , 因此保证了长片段外源基因的整合率 , 可消除和减弱基因整合后的位置效应。 Fujiwara 等建立了 210 kb YAC DNA 转基因小鼠,在乳腺获得高水平表达人乳白蛋白,而未表 现出普通转基因鼠所出现的位置效应。 1.5 性腺转基因方法 早期的动物转基因研究中, 大量应用了利用逆转录病毒介导、显微注射、电穿孔、脂质体 介导、 精子载体法等方法, 这些方法需要复杂的操作仪器和胚胎体外培养等复杂的实验过程, 同时获得转基因动物的效率很低, 一般不到 10%。Kim et al 根据精子作为外源基因载体转 基因的原理, 及一般细胞都能够吸收外源 DNA 的原理, 把外源基因用脂质体转染精原细胞, 再将被转染的精原细胞微注射到精原细胞被破坏的雄性动物的睾丸的曲精细管内 , 结果发 现小鼠在康复后可以产生携带外源基因的精子。 如果利用这样的小鼠对雌鼠交配, 可以预期 能够产生含有所转外源基因的转基因小鼠。 沈新明等省略了对精原细胞转染外源基因并对曲 精细胞移植转染细胞的步骤 , 直接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达 载体注射到小鼠的曲精细管内, 最后通过与雌鼠交配, 成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基 因仔鼠。Yuan et al.报道向通过向曲精细管内注射外源 DNA, 然后再结合对曲精细管电击或 电穿孔处理, 以使外源基因进入睾丸生精细胞。然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配, 得到的 小鼠中有一组的阳性检测率达 25%。 Shen et al.则将处理方法更为简化, 首先直接向雄兔睾丸 内注射携带绿色荧光表达的外源 DNA 及二甲基亚枫的介质, 使 DNA 能够进入睾丸细胞和 生精细胞。 一个月后用处理的雄兔与雌兔交配, 所产生后代的 56%仔兔能高效地表达所导入 的外源基因。 这一转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法 2 [5] [4] [3] 的结果。对应于在雄性动物的向睾丸注射外源基因,Yang et al. [6] 直接对小鼠的卵巢注射绿色 荧光蛋白基因, 也可以得到转基因小鼠, 并且检测后代的阳性率达 54%, 并且发现获得的 6 代以内的转基因小鼠都具有较好的遗传稳定性。 用同样的方法制作转基因鸡的研究中, 阳性 率高达 67.65%。由于通过性腺转基因操作简便、技术要求较低、难度较小, 这种方法将成 为一个制作转基因动物的方向, 有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。然而该方法制 备转基因动物时, 仍然存在外源基因随机整合进入与宿主基因组的问题, 因此目前还无法利 用此方法随意地获得理想的转基因动物。 1.6 定点制作转基因动物的方法 由于非定点转基因方法使外源基因随机整合到宿主细胞染色体上 , 使得制作转基因动物 带有很大的偶然性, 外源基因的表达的可控性也较差。 同时由于外源基因随机整合到宿主基 因组, 很可能破坏宿主基因的正常表达, 将影响到宿主的发育和存活。因此新的定点整合转 基因方法就应运而生了, 一般通称为基因打靶( gene targeting) 。 1.6.1 胚胎干细胞(ES 细胞)基因打靶方法 基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的可对基因组进行定点修 饰的实验技术。基因打靶通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组、精细地定点修饰 和改造基因 DNA 片段, 具有位点专一性强和打靶后目的片段可以与染色体 DNA 共同稳定 遗传的特点。Thomas and Capecch 首先对小鼠 ES 细胞进行了基因打靶, 然后将此打靶的 ES 细胞移植进入小鼠囊胚, 将此重组胚胎移植进入代孕母鼠, 最后产出嵌合体仔鼠,通过相 互交配获得基因敲除的纯合小鼠。 基因打靶包括基因敲除( knock out) 和基因敲入( knock in) 技术。目前利用以上技术已经制备了大量基因敲除小鼠, 在研究基因功能和疾病模型研究方 面做出了贡献。相应地, 外源基因也可以通过基因打靶转入小鼠基因组, 并获得了通过基因 敲入的转基因小鼠, 实现了外源基因在宿主基因组的定点整合。 1.6.2 对体细胞进行基因打靶 虽然 ES 细胞具有全能性, 并且具有无限传代和增殖的能力, 但是由于目前尚未建立起一 套有效的完善的适用于任何物种 ES 细胞的分离和培养方法, 到目前为止很多物种尚未得到 ES 细胞, 而体细胞便于采集、 数量巨大, 并可以在体外增殖培养, 所以通过对体细胞进行基 因打靶, 使外源性基因定点的整合到体细胞的基因组中, 再结合体细胞克隆来生产转基因动 物将是一个不错的选择。 McCreath etal.报道了用体细胞核移植生产出了基因打靶绵羊。 Lai et al. 和 Dai et al. 报道了用基因打靶及克隆的方法制作出了敲除α 1,3- 糖苷转移酶的转基因 猪, Kuroiwa et al.通过敲除牛朊蛋白( PRNP) 基因制作了无疯牛病的牛, 不会发生乳房炎的 3 [7] 奶牛和能够合成多不饱和脂肪酸的猪也被制备到。 体细胞基因打靶结合克隆的方法早就定型, 问题是如何提高体细胞克隆的效率。 对此, Kuroiwa etal.通过对基因印记较少和较为年轻化的 胎牛成纤维细胞进行基因打靶, 细胞经过克隆后构建重组胚胎并移植到子宫内发育成 2.5 月龄的胎儿, 再将此胎儿流产并再次分离出成纤维细胞, 对此进行重复打靶获得纯合型基因 敲除细胞, 然后再进行克隆胚的构建和移植, 重组胚胎移植后怀孕 45 d 的受胎率达到 45%。 此方法大大提高了基因敲除动物的制备效率, 经过 5 次移植、流产、胎儿成纤维细胞分离、 基因打靶和重构胚胎制备的循环, 在 22 个月内生产了按传统方法需要 6 年时间才能获得的 纯合敲除 PRNP 和 IGHM 两个基因的牛。一般在体细胞克隆研究中都是制备异体克隆即提 供细胞核的供体动物都不同于提供卵母细胞的受体动物。 异体克隆胚胎可能由于基因印记可 能导致核质相互作用的不协调, 致使目前制备克隆动物的效率都很低。为了解决这一问题 , Yang et al .[8] 把体细胞核移植入源于同一母牛的去核卵子, 克隆后激活的同体重组胚中基因 重排要大大优于异体重组胚; 同体重组胚的囊胚发育率达 38.5%, 高于异体胚的 22%; 同体 重组胚胎移植后克隆动物出生率达 23%, 高于异体胚的 5.6%。 1.6.3 对原始生殖细胞( PGC) 进行基因打靶 PGC 类似于 ES 细胞, 具有发育全能性。 PGC 介导的转基因技术在原理和方法上与 ES 细 胞技术相似 , 应用 PGC 技术在制作转基因家禽方面有特别明显的优势。 Brinster and Avarbock 尝试了在雄性哺乳动物个体之间转移精原细胞的可行性 , 研究者将设计好的 Z FlacZ 系供体小鼠的 PGC 植入 C57BL6×STL 杂交一代小鼠的曲精细管, 经移植后的 PGC 能够发育成具有受精能力的精子细胞, 并产生了后代。Mueller et al.报道从转基因猪分离和 培养出的 PGC 能用于制作嵌合体 , 从而证实 PGC 具有一定的嵌合能力 , 也显示了利用 PGC 进行转基因猪或其它大动物的可能性。禽类至今尚未得到 ES 细胞, 其卵子和胚胎结 构也不允许像哺乳动物那样进行胚胎克隆以生产转基因动物。 但目前已经分离培养了多种禽 类的 PGC, 并且可以把 PGC 移植入发育中的胚胎的原始生殖腺并制作嵌合体禽类。van de Lavoir et al. [9] 将基因打靶的携带能表达绿色荧光蛋白基因的 PGC 注入孵化 3 d 发育至 13~15 期的鸡胚内, 获得 8 只公雏, 成长后与母鸡交配产生 7 只生殖腺有转入外源基因和 带有绿色荧光的转基因雏鸡。这一成功为今后进行禽类的定点转基因提供了示范。 2 转基因动物技术的应用现状 转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基 因组,并能遗传给后代的动物。 目前,转基因动物的研究主要包括三个方面:(1)利用转基因技 术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造 4 具有生物活性的产物,包括和生物反应器。(3)利用转基因动物确定研究手段,包括 建立疾病模型和发育调控。 2.1 促进动物生长 生长激素(GH)基因是转基因研究中最早运用的,至今已生产出转基因家禽、啮齿类、鱼 类、昆虫等多种属性的动物。Hammer 等 [10] (1985)利用显微注射法将人生长激素基因转移 到兔、绵羊和猪中均获得成功。国内外大量的转基因家畜 GH 均能表达,但 GH 的表达水 平在不同的转基因实验之间和同一转基因实验的不同动物个体之间差异很大。 国外生产的 转基因猪中 GH 产物得到表达,血浆中 GH 水平持续地提高,转基因猪的生长速度比较快,饲 料利用率提高 17%,胴体脂肪为对照组的 50%。20 世纪 80 年代中后期,新疆畜牧科学院与 北京农业大学合作,用精子载体人工法获得了含有牛生长激素基因的转基因绵羊。结果表 明,转基因绵羊比普通绵羊生长速度快,周岁体重较高。有不少研究发现,在提高动物生长速 度的同时也带来了一些副作用,如在转 GH 基因动物中,死胎和畸形率较高,得关节炎、胃溃 疡、肾病和繁殖力下降的转基因动物较多,这可能与转基因整合位点不当和 GH 表达水平 失控有关。另外,对猪进行 GH 基因发现,较异原生长激素基因的猪生长速度快。 2.2 改善产品品质 外源基因不仅能在转基因动物中得到整合和表达 ,而且能获得组织特异性表达 ,因此,只 要转入相关的基因,不仅可以提高乳、肉、蛋、皮毛等畜产品的产量,而且也可以改变畜产 品质量,这是常规育种和突变方法所不能完成的。在改变产乳性状方面,主要以羊和奶牛为 转基因对象。西方国家如英国、美国、法国、瑞士和荷兰都已相继开展研究,并取得了一 定进展。Simious 等首先用绵羊的β -乳球蛋白(BLG)基因产生了转基因小鼠并获得表达, 其乳汁中所含的绵羊β -乳球蛋白的量要比正常绵羊乳汁高 5 倍。 随后又用 BLG-FIX(人凝 血因子 IX)和 BLG-α 1AT(人α 1-抗胰蛋白酶)基因获得了转基因绵羊,并从其乳汁中测出了 人凝血因子和人α -抗胰蛋白酶。Murray 等将人乳溶菌酶基因导入小鼠获得了有活性的乳 腺专一性表达,通过这一途径有可能实现对乳用家畜乳用成分的改良,乳汁成分中溶菌酶含 量的提高,不仅可以减少乳畜乳房炎的发生,还能延长奶的保鲜期。 在改善肉质方面,许多研 究都已证实,GH 具有明显抑制脂肪生成的作用,而且还有一定的催乳特性,转有 GH 基因的 家畜,体脂减少,瘦肉率明显提高,利用 GH 基因抑制脂肪生成的特性,可对瘦肉型猪进行定 向育种和培育。通过一定的导入途径将 GH 基因导入产毛家畜,可提高产毛家畜的生长速 度并增大其体型,进而提高产毛量。 除此之外,还可以导入一些与产毛性能有关的基因,目前 研究较多的是角蛋白纤丝基因,与胱氨酸合成有关的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)和 D-乙酰丝 5 氨酸硫化脱氢酶(DAS)基因等。 澳大利亚已有两个实验室正在进行这方面的研究,他们分别 从大肠杆菌和沙门氏菌中分离到 SAT 和 DAS 基因并且经基因转移获得了转基因小鼠和转 基因绵羊。最近已有报道,带有提高羊毛产量特征的转基因羊已产生。目前,人们开始用转 基因手段培育超细型细毛羊,并准备将彩色毛基因导入绵羊以生产彩色羊毛,这无疑对羊毛 生产及纺织业带来巨大影响。 2.3 提高抗病性 提高家畜生产性能和改善畜产品质量一样,利用转基因技术提高动物的抗病性具有十分 乐观的应用前景。在对各种动物的抗病基因转移研究中 ,以对鸡的抗病效果较显著 [11,12] 。 1989 年美国农业部以禽白血病病毒(ALV)为载体,获得了抗 ALV 的新品系鸡。王敏华等报 道,用 OMT 与抗猪瘟病毒的核酶基因相融合,经基因转移后用以指导抗猪瘟病毒的核酶基 因在转基因兔中的表达,检测表明,转基因兔获得了一定表达。 2.4 动物生物反应器 一般把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物叫动物生物反应器,转基因 最为诱人的前景是利用他生产人类所需的生物活性物质或药用珍稀蛋白,这已引起了国内 外学者和开发商的高度重视。 Sharma 等(1994)用同源性猪β 猪蛋白基因作启动子连接人的 β 猪蛋白基因做组编码区在转基因猪中高效表达人的血红蛋白,这表明通过转基因猪大规 模生产人血红蛋白是可能的。 目前已成功在山羊、 猪和绵羊乳中生产出组织血纤维蛋白溶 酶原激活因子和抗凝血因子(t-PA),血凝集因子Ⅷ和Ⅸ以及蛋白 C。在转基因家畜血液中得 到了人免疫球蛋白α 1 球蛋白、β 球蛋白、干扰素、胰蛋白酶和生长激素等,而且这些蛋白 都具有正常的生物活性。 2.5 按供体与受体遗体距离的远近可分为两种类型:相近种系和远离种系间异种器 官移植。异种排异反应甚为迅速和剧烈,例如:异种移植的心脏在几分钟至几小时 内即可被排斥而丧失功能。为了防止补体介导的异种移植后超级排异反应,近年来,国外学 者提出了两条途径:一条途径是通过对受体动物循环血中的补体清除,使供体心脏不受补体 的攻击。首先采用此法进行猪-猴心脏移植达到了延长心脏存活的目的。另一条途径是通 过转基因技术,即通过克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中,使之在供 体心血管内上皮表达,采用这种转基因动物心脏进行异种移植后,就可避免超级排异反应的 发生,其效果类似于同种心脏移植。 2.6 建立人类遗传疾病模型进行基因治疗 6 基因治疗主要是将正常的外源基因植入人体靶细胞以取代有缺陷的基因,恢复该基因的 功能或提供一种新的治疗功能,以改善相关症状,达到治疗基因病的目的。最早的基因治疗 可追溯到 20 世纪 80 年代初。80 年代后期,从小鼠到灵长类等一系列动物基因转移研究模 型获得成功。 我国基因治疗研究始于 80 年代末,1987 年成立了第一个进行基因治疗研究的 实验室,短短几年内,已取得显著的成绩,首例基因治疗血友病患者获得成功(1991)。 3 存在问题及展望 未来转基因技术在猪、牛、羊、兔等家畜中获得成功,并已得到初步应用,但目前还存在 一系列问题制约着转基因动物的生产规模,限制着转基因动物产品的研究与开发。存在的 问题有:成本高,效率低;转基因的表达不理想;目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出; 社会对转基因动物的可接受性还有待于进一步论证等。 虽然转基因技术还存在一定的局限 性,但经过几十年的发展,转基因动物的研究取得了长足的进步,研究方法也日新月异,在各 个领域展现出美好的前景。许多生物学家预言“21 世纪将是人类向生物技术要粮食、要 奶、肉、蛋的世纪”,利用转基因动物造福人类的前景无疑是光明而诱人的。 参考文献: [1]Palmiter RD.,Brinster RL.,et al.Dramatic growth of mice that de-velop from eggs microinjected with metallothione in growth hormonefusiongenes〔J〕.Nature,1982,300:611~615 [2]Gordon JW.,Scangos GA.,Plotrin DJ.,et al.Genetic transformationof mouse embryo by microinjection of purified DNA〔J〕.Proc Natl A-cad Sci USA,1980,77:7380~7384 [3]Haskell RE.,et al.Efficient production of transgenic cattal by retrovi-ral infertion of eearlyembryos〔J〕.Molreprod Dev,1995,40:386~390 [4]安晓荣,等.体细胞核移植法生产绵羊转基因囊胚〔J〕.科学通报,2001,46:810~813 [5]Kim J H, Jung-Ha H S, Lee H T and Chung K S. 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